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技术信息资源速递(第七十四期)
阅读次数:574   添加时间:2016-10-8

技  术  信  息  资  源  速  递

第七期(总第74期)

(2016年9月)

行业动态:

2015年度“中国生命科学领域十大进展”

剪接体的三维结构以及RNA剪接的分子结构基础研究;高等植物光系统/光合膜蛋白超分子复合物晶体结构解析;化学重编程中间状态的鉴定和化学重编新体系的建立;口服重组幽门螺杆菌疫苗研究;细胞炎性坏死机制研究;水稻感受和抵御低温的机制研究;细胞内胆固醇运输的新机制;昆虫长、短翅可塑性发育的分子‘开关’;磁受体蛋白MagR的发现;发育过程中人类原始生殖细胞基因表达网络的表观遗传调控。(科技导报,2016年第13期)

 

循环性能稳定的新型锂硫电池

2016 年6 月30 日,日本产业技术综合研究所(产经研)对外宣布,其节能研究部开发的具有金属有机结构的锂硫电池已取得成功。

以硫作为锂离子电池的正极材料,具有正极容量高(理论值为1 675 mA·h/g)的特点,但是在放电反应过程中产生的中间产物多硫化锂容易溶解于电解液中。随着充放电循环的进行,溶解后的多硫化物离子会引发氧化还原反应,从而导致电池容量的下降。

产经研研究小组采用金属有机骨架制成分子筛,从而限制了多硫化物向负极的移动。同时为了克服技术有机骨架易破碎的缺点,研究人员通过混入氧化石墨烯层制成了具有一定柔韧性的复合金属有机骨架薄膜。加入该骨架薄膜后,室温下反复1 500 次充放电,放电容量几乎没有劣化,循环性能良好,充电容量仍可保持900 mA·h/g 的水平。详情请参阅英国学术期刊《Nature  Energy》于2016 年6 月27 日发表在网络版上的文章。(无机盐工业,2016年第8期)

 

用于太阳能控制窗的生物基BOPET薄膜

位于美国北金斯敦的东丽塑料公司推出了生物基双向拉伸PET(BOPET)薄膜系列,用于商业和住宅应用的太阳能控制窗膜的制造。Lumirror品牌BioView PET薄膜的生产采用东丽公司专有的可持续树脂共混物,其中包含约30%的可再生原料。

新薄膜在制造、安装过程中的性能与传统的太阳能窗膜相同,可用于清晰度要求极高在技术上要求苛刻的应用。东丽的BioView膜是多层结构,其表面和光学质量严格由公司的专有共挤技术控制。所说它具有非常低的雾度、出色的操作和加工特性,以及高耐划伤性。

作为制造太阳能窗膜应用传统薄膜的全球领导者,东丽塑料已经站在了生物基树脂技术的前沿。事实上,该公司正有计划有条不紊地进行开发工作,正申请专利采用完全可持续的原料生产BOPET薄膜,用于生产太阳能控制窗膜。(塑料工业,2016年第8期)

 

2016 年美国总统绿色化学挑战奖简介

2016 年6 月13 日(美国东部时间),美国环境保护署(EPA)在其官方网站公布了2016 年美国总统绿色化学挑战奖获奖项目名单,2016 年EPA 将更绿色化学品设计奖和特定环境效益:气候变化奖,合并为一个奖项。本文介绍今年5 个奖项的得主及其成果。

1 学术奖(Academic Award)

2016 年的学术奖授予普林斯顿大学的Paul J.CHIRIK 教授,CHIRIK 教授发现在空气中稳定性高、易合成、活性高以及选择性高的铁钴催化剂,以代替昂贵的铂催化剂用于有机硅生产。

从先进材料到新药物合成,都离不开金属催化反应。数十年以来都是采用贵金属催化剂,例如钯、铂、铑及铱,除了价格昂贵、毒性大之外,提取这些贵金属也会为环境带来负担。获得一盎司的贵金属,需要采掘十吨的矿石,产生的CO2 相当于得到同样质量铁的6000 倍。

有机硅可用于有机硅橡胶、轮胎、洗发水、日用纤维、纸张涂料以及其他消费品。目前,在有机硅的工业生产中,使用的是铂催化剂。但铂催化剂不能回收,且会带来安全及环境压力。CHIRIK 教授与Momentive 高性能材料公司合作,发现了一种新型的、比铂催化剂性能更好的、基于“金属配体协同”的硅氢加成铁钴催化剂,无副产物,无产物蒸馏步骤,可广泛用于硅氢化来制造商用有机硅材料生产,并将引起商用有机硅产品的工业生产发生转变。

这种新型催化剂可以减少贵金属矿石的开采,由此,除了可以减少成本之外,每年还可以减少850亿英热(BTU)的能量消耗、8500 万吨的废弃物以及2.17 万吨的碳生成。

2 更绿色化学品设计和特定环境效益:气候变化奖(Designing Greener Chemicals and Specific Environmental Benefit:Climate Change Award)

Newlight Technologies 公司因用生物催化剂将空气中的甲烷,在室温、环保的条件下制成高性能热塑性AirCarbonTM 材料,而获得2016 更绿色化学制品设计和特定环境效益:气候变化奖。

甲烷可在自然界中,如湿地中产生,在美国,它也是由人类活动产生的第二大温室气体,可由如天然气系统的泄露以及家畜产生。甲烷在大气中的存在时间比CO2 要短得多,但是在一百多年来,甲烷对气候变化的影响比CO2 要强25 倍。

聚羟基脂肪酸酯聚合酶是在生物催化剂中用于合成主要聚合物的酶,Newlight 公司开发的一种已商业化的方法,即在生物催化聚合物合成过程中控制该酶的负反应,使生物催化剂可以一直不会因“自我关闭”而失活,聚合规模大大超过了之前技术的最大限制(1∶1),达到每1 千克生物催化剂就生成9 千克的聚合物(1∶9),优于石化技术(1∶3)。除性能上优于石油基塑料外,Newlight 公司的AirCarbonTM材料生产技术还可以减少1/3 的操作单元和1/5 的经济消耗。相对于石油基塑料,AirCarbonTM材料在价格和性能上都具有商业竞争优势。

自2013 年始的两年内,AirCarbonTM 材料已应用于Dell、Hewlett-Packard、Ikea、KI、Sprint、The Body Shop 以及Virgin 等公司。作为石油塑料替代品,其净排碳量为负值且性价比高。

3 更绿色反应条件奖( Greener Reaction Conditions Award)

Dow Agrosciences LLC 因高效利用氮肥的Instinct ®技术荣获2016 年更绿色反应条件奖。

营养物污染是美国最广泛以及昂贵的危害环境的问题之一。据估计,所有排放75%的N2O 来自农业的氮肥。土壤细菌迅速将尿素以及氨中的氮(铵态氮)转化为硝酸盐(硝态氮);硝态氮更容易从植物根部浸出流失或者以N2O 溢出,对于环境的破坏也更加明显。

N-Serve®是Dow 公司在1974 年商业化的氮肥稳定剂,它抑制土壤细菌将铵态氮转化为硝态氮。在生长季节内使用,植物根部的铵态氮存留更长时间,提高了氮的使用效率,并且减少硝态氮因为浸出或者以N2O 溢出而带来的流失。但是由于它的物理化学性质,只能用于无水氨肥的使用。

在2010 年,Dow Agrosciences 公司推出微胶囊悬水浮剂Instinct®,这项专利技术可便捷地应用于常见的氮肥和多种农作物当中,还降低了所处理过土壤中石油基溶剂的含量,从而带来额外的环境效益。

在美国,仅2014 年,估计这项技术已经减少约为66.4 千万吨CO2 排放,额外增收5 千万蒲式耳的玉米,超过2.05 亿美元的收入。

4 更绿色合成路线奖( Greener Synthetic Pathways Award)

CB&I 以及Albemarle 两家公司的AlkyClean®技术获得2016 年更绿色合成路线奖。

烷基化物具有较低蒸汽压、高辛烷值,是不含有芳烃、烯烃及硫的异构化烷烃,且为更好的清洁汽油成分。每年的全球产量有3 百亿加仑,其中有60%是在北美。烷基化物是由异丁烷和轻烯烃(C3~C5),在氢氟酸和硫酸液体催化反应中合成的。氢氟酸和硫酸有很强腐蚀性,氢氟酸还具有很强的毒性。在超过四十年的时间里,科学家们都在尝试将液体酸技术替换成更加环保的固体酸催化剂技术。先前的方法存在催化剂选择性差或寿命短,再生困难或催化剂使产品中含有腐蚀性成分,如卤素、三氟甲酸、三氟化硼问题等。

AlkyClean®技术使用CB&I 公司的新型反应器和Albemarle 公司的AlkyStarTM 沸石催化剂,商业化生产更安全的、高质量的烷基化物,还不产生酸溶性油和废酸,不需要后处理。AlkyStarTM 催化剂是优化酸的量、强度、催化剂的粒子大小以及孔隙率沸石催化剂。

2015 年8 月,利用AlkyClean®技术,全球第一座产能为2700 桶的工厂开始商业化生产符合现有质量指标的烷基化产物,达到并超过了预期效果。

5 小企业奖(Small Business Award)

2016 年的小企业奖授予Verdezyne 公司。

Verdezyne 公司发明的发酵技术平台,提供一种利用可再生物质代替现在石化产品的二羧酸,如己二酸、癸二酸以及十二烷二酸(DDDA)。已经商业化的是BIOLONTM DDDA,首先用于尼龙6,12 的制造,尼龙6,12 用于制造需要特殊性能的工程塑料,例如抗高化学品、抗湿度、抗磨损的工程材料;DDDA 还可用于制造胶黏剂、涂料、腐蚀抑制剂、润滑剂、香水等。

目前,全球每年1 亿磅的DDDA都是石化产品,主要是三聚丁二烯, 再经氢化及硝酸氧化。BIOLONTM的DDDA是利用植物油作为原始原料提炼的脂肪酸作为原料,通过Verdezyne 公司的专利产品——经基因工程处理念珠菌酵母,快速、高效地经一个三步ω-氧化生化途径将烷烃(或者脂肪酸)的末端氧化成DDDA。同时最小化中间体积累途径以避免该微生物中毒而影响最终产品的纯度。

利用BIOLONTM DDDA 技术,Verdezyne 公司迄今的产量超过70000 磅,并且获得了美国农业部认证的生物基产品标签。该公司的第一个商业化生产设施将计划在2017 年投产。(化工进展,2016年第9期)

 

美国化学文摘社发布ChenZentTM持续提供化学资源

美国化学文摘社(CAS)发布ChemZent—可在Sci Finder 中购买的全新解决方案。ChemZent收录了《德国化学文摘》中全部的近300 万条摘要。

将ChemZent 集成到Sci Finder 中,能够使研究人员在日常工作流程中使用熟悉的Sci Finder功能,探索、发现并提取历史化学信息。ChemZent 中涉及的物质和概念来源于原版德文摘要,经过英文翻译和编写索引,便于人们发现查找。ChemZent 的特色还包括:(1) 文摘标记能够在原版德文PDF 中定位文摘;(2)由CAS 管理的词汇表提高可发现性;(3)摘要的德文原版和英文翻译都可供打印和导出。

CAS 产品与内容运营高级副总裁马修·图森博士表示:“许多影响当今化学领域的基础理论和假设都能在《德国化学文摘》中找到。但在ChemZent 集成到Sci Finder之前,几乎不可能对这些化学文摘的历史文献进行详尽的检索。研究人员只能在没有检索功能的情况下研究档案,而且语言障碍也使检索的收获大打折扣。通过ChemZent,CAS 提供了一种高效的方式,帮助使用者在现有Sci Finder 工作流程中重新发现这些宝贵的历史材料,充分利用最全面的检索结果来促进科学创新。”(上海化工,2016年第8期)

 

韩国研究用石墨烯制成柔性糖尿病管理贴片

韩国科学家开发出一种可穿戴式糖尿病管理贴片。这种仅有一张扑克牌大小的透明塑料薄片,在被贴在皮肤上后,不仅能监测血糖水平,还能在必要时通过皮肤释放药物降低血糖水平。

新研究采用的汗水检测法。由于葡萄糖传感器基于酶,会受到汗液中酸碱度变化的影响,酸碱度和温度传感器通过实时监测这两个参数,调整葡萄糖传感器的测量值,进一步提高了葡萄糖测量的可靠性。除测量葡萄糖水平外,该装置还能对其进行调节,当贴片探测到汗液中的高葡萄糖水平时,其中嵌入的加热器会触发微针,溶解外壳,释放降糖药物二甲双胍。研究人员报告称,他们已在糖尿病小鼠和两位健康男性人类身上进行了实验并获得了成功。(石油化工,2016年第8期)

 

Siluria公司证明突破性甲烷制乙烯技术的商业可行性并准备扩大规模

新工艺技术的开发者Siluria技术公司宣布,在其德克萨斯州La Porte示范装置第一年成功运营,已经证明了其甲烷氧化偶联制乙烯(OCM)技术的商业可行性,并准备推进到美国及海外建商业化装置。

Siluria公司的OCM技术是直接将天然气转化成乙烯的首例商业化工艺。该La Porte装置,由Siluria公司全资拥有,与Braskem美国公司运营的聚合物装置位于一处,在2015年初开始运营。该示范装置是Siluria公司的OCM工艺技术的最终预商用放大。Braskem公司世界一流的运行团队与Siluria公司密切合作,是使这一示范装置取得成功的关键。无论是专有的催化剂还是OCM工艺都在示范装置上可靠地实施,进一步验证其多年中试装置操作的商业化性能,这为在美国和海外推进商业化乙烯生产项目的进程铺平了道路。

Linde工程公司与Siluria技术公司将共同努力为市场提供这种突破性的技术。自2015年初示范装置启动,Siluria公司已完成旨在重现客户定制商业运行条件下的18次测试活动,包括不同温度、压力、流量和入口气体组成。Siluria公司还充分验证了原料的灵活性,并改变可掺入该工艺作为共同进料的乙烷的量。Siluria公司计划继续利用La Porte设施,以推进其OCM技术,利用该装置产生的数据改进其专有模型并细化用于商业化装置的设计基础。该装置还将使Siluria公司通过开 发和测试新的催化剂及工艺技术,以推进其领先的竞争地位。(石油化工,2016年第8期)

 

医学植入重大突破赢创研发可生物降解高强度复合材料

全球著名材料制造商化工巨头赢创工业集团,目前正在研发先进的可生物降解的高强度复合材料。这些材料有望代替金属作为骨折内部固定的植入物。植入物对支撑骨骼的愈合起到至关重要的作用。

目前使用的金属植入物或永久留在人体内,或需通过额外的手术取出。相比而言,赢创新型复合材料制成的植入物在骨骼愈合的过程中能被人体自然吸收。

这些材料由聚合物和骨骼中自然存在的物质组成。赢创的这项研究仍处于初期阶段,但它对于患者的潜在福利已显而易见。患者将无需进行额外的手术取出植入物。特殊的器械设计还有助于骨骼更快速地再生。(化工新型材料,2016年第8期)

 

俄罗斯开发出从工业废弃物中提取稀土元素新技术

俄罗斯国立研究型技术大学莫斯科钢铁合金学院和俄罗斯国家原子能公司“领先化学工艺研究院”股份公司组成的研究团队,开发出从化肥生产的废弃物—磷石膏中提取具有重要战略意义的稀土元素的方法,从而减少稀土的进口。

     稀土被广泛用于激光、电子及电脑等高科技产品的生产,并以年产量15%的速度递增,中国是世界上最大的稀土生产国。

俄罗斯用硫酸处理磷灰石来生产磷肥,其间产生的工业废弃物磷石膏约有3.2亿t,其中含有约80%-98%广泛用于建材行业的石膏成分,以及80万t的稀土元素。

     这项创新型新技术可以一步解决3个问题:从工业废弃物中提取重要的稀土金属、建筑材料石膏,以及废弃物的回收再利用。研究人员已开始试生产,计划于2016年生产出首批稀土产品(化工新型材料,2016年第8期)

 

 

动态题录:

超韧薄膜用新型PE树脂(塑料工业,2016年第8期)

俄罗斯开发出制备超高分子量聚乙烯新技术(工程塑料应用,2016年第8期)

世界单体最大尿素工程污水处理站开工(化工环保,2016年第4期)

化工园区面临洗牌,工信部编制危化品企业搬迁方案(化工环保,2016年第4期)

美国哈佛大学成功研制变形材料(石油化工,2016年第8期)

沙特基础工业公司致力于美国页岩气作为主要的化工原料(石油化工,2016年第8期)

神木废水预处理技术节水增效(石油化工,2016年第8期)

ExxonMobil公司推出新型PE树脂用于超韧薄膜应用(石油化工,2016年第8期)

2015全球化工50强榜单出炉 巴斯夫雄踞榜首(化工时刊,2016年第8期)

我国已制定农药残留限量标准超5000项(化工时刊,2016年第8期)

近期多项利好支撑PVC价格未来或仍有涨价空间(聚氯乙烯,2016年第8期)

北美地区上半年PVC销量增长势头强劲(聚氯乙烯,2016年第8期)

 

 

 

论文摘要:

光学硅橡胶表面低透气性涂层的制备与性能研究

通过合成折射率与白炭黑相匹配的苯基乙烯基硅油和苯基含氢硅油,以白炭黑补强,固化后获得光学透明的苯基硅橡胶,然后以四甲基己二胺为催化剂,使喷涂在苯基硅橡胶表面的有机聚硅氮烷(OPSZ)实现低温固化及硅质转变,获得具有低气体渗透性的致密涂层,并对涂层的光学性能、透氧量、抗硫化性能进行测试和表征,结果表明:OPSZ涂层表面连续、均匀、致密,无裂纹和空隙。涂层断面致密均匀,无缝隙和裂纹,当涂层厚度低于32-35μm时,涂层与硅橡胶间的粘接力良好。固化后的OPSZ显示出优秀的透明度、透光性能和气体屏蔽性能。当涂层厚度达到12μm以后,透氧量保持不变,涂覆涂层后的封装灯珠均显示良好的抗硫化能力,硫化后光通量维持率在99.9%以上。提高加热温度和相对湿度,可以有效地缩短硅质转化的时间。(精细化工,2016年第9期)

 

Ga2O3/凹凸棒石复合催化剂的制备和肉桂酸环己酯的催化合成

采用浸渍法由凹凸棒石负载氧化镓(Ga2O3)制备了Ga2O3/凹凸棒石复合催化剂。用IR、XRD、BET、TEM等对催化剂结构进行了表征,并通过肉桂酸环己酯的合成,对催化剂制备条件、催化活性和反应动力学特性进行了考察。结果表明,催化剂的最佳制备条件是Ga2O3负载量为催化剂总质量的10 %,焙烧温度450 ℃;在肉桂酸环己酯合成过程中,当n(肉桂酸):n(环己醇)=1:4.5(其中肉桂酸0.02 mol),催化剂用量0.5 g,反应温度130 ℃,反应时间70 min时,产品平均酯化率为95.0 %,催化剂经5次重复使用,酯化率仍达81.5 %;反应为准二级反应,表观活化能为90.78 kJ/mol,130 ℃时反应速率常数为1.03×10-2 L/(mol·min)。(精细化工,2016年第9期)

 

无机杂化海藻酸钠渗透汽化膜的制备与分离性能对比

为提高海藻酸钠(SA)膜的渗透汽化分离性能,分别采用纳米氧化铝、纳米氧化锆和纳米氧化钛对SA膜进行改性,对比分析了3种不同杂化膜渗透汽化分离性能的差异,并将分离性能较好的杂化膜应用到乙酸与乙醇酯化反应脱水的体系中。系统考察了无机纳米粒子含量对SA膜渗透汽化分离性能的影响,对杂化膜进行了接触角、傅里叶红外(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、热重/差示扫描量热(TG/DSC)、X射线衍射(XRD)和拉伸强度等表征与分析。结果表明,无机纳米粒子能提高SA膜的热稳定性、机械强度和渗透通量,当无机纳米粒子与SA质量比为0.3时,掺杂TiO2、ZrO2和Al2O3的杂化膜二碘甲烷的接触角依次升高,同时渗透通量也依次升高。SA-0.3Al2O3杂化膜亲水性较好,然而SA-0.3ZrO2杂化膜分离性能最优,50℃下分离水含量10%的乙醇-水溶液,膜渗透通量达到336 g·m-2·h-1,渗透侧水含量99.97%,分离因子29990。酯化反应脱水实验表明,在80℃时,酯化反应脱水实验乙酸转化率均高于无脱水实验乙酸转化率,平衡转化率不断被打破,反应12 h后,转化率由平衡时的79.3%提高到93.9%。(化工学报,2016年第9期)

 

干气密封的实际气体焦耳-汤姆逊效应分析

干气密封系统中气体通过过滤器、阀门、孔板和密封端面等组件时会发生焦耳-汤姆逊(JT)效应,可能导致密封气温度降低,甚至出现液相凝析。焦耳-汤姆逊效应一般通过焦耳-汤姆逊系数来反映。针对干气密封常面临的氢气、氮气、空气和二氧化碳,利用VDW方程、RK方程、SRK方程和PR方程4个经典状态方程(EOS)分别计算了相应的焦耳-汤姆逊(JT)系数,并与文献实验数据进行了比较,选择最佳状态方程作出各气体的JT系数曲线和焦耳-汤姆逊反转曲线(JTIC),并利用编程计算出空气和氮气通过干气密封端面时,由于JT效应引起的气体温降。结果表明:实际气体的焦耳-汤姆逊效应,对干气密封的节流环节会产生重要影响。常温条件下,氢气发生致热效应,而氮气、空气和二氧化碳气体发生致冷效应。采用4种状态方程计算焦耳-汤姆逊系数时,RK方程的平均相对误差和最大相对误差最低且分别小于4%和10%。干气密封气体的实际气体焦耳-汤姆逊效应能引起较大的温度变化,其中气体介质压力比介质温度对温差的影响更大。压力较小时JT效应引起的温降可以忽略。(化工学报,2016年第9期)

 

刮膜式分子蒸馏器传热特性及壁面优化

使用CFD软件建立了刮膜式分子蒸馏器的三维模型,以EHP-EHS混合物为研究对象,并通过编写用户自定义函数(UDF),研究刮膜式分子蒸馏过程传质存在时的传热特性,得到充分发展的温度场及流场,分析了蒸发壁面温度的分布及转子转速对其影响和局部Nu数的分布。结果表明:液膜表面的升温过程是周期地和波动地达到动态稳定温度的;转子转速越大,周期越小,温度波动次数越多,温度稳定性越好;局部Nu数在刮膜器刮擦的位置突增,刮膜器的刮擦作用是影响平均Nu数增大的主要因素。经过壁面优化,液体湍流程度增大,传热效果得到不同程度的增强,凸起矩形排列、三角形排列、螺旋形排列时平均Nu数分别是光滑蒸发面的1.32倍、1.23倍、1.04倍,为进一步优化刮膜式分子蒸馏器提供参考。(化工进展,2016年第9期)

 

二次水热合成法制备ZSM-5分子筛膜及其渗透汽化性能

采用二次水热合成法在管状多孔莫来石支撑体上制备高耐酸性ZSM-5分子筛膜,系统地研究分子筛晶种和合成溶胶中H2O/SiO2摩尔比率对ZSM-5分子筛膜生长与渗透汽化性能的影响,采用X射线衍射、冷场扫描电子显微镜和电子能谱等表征技术分别对制备的ZSM-5分子筛及其ZSM-5分子筛膜的结构、形貌和Si/Al比进行表征。针对分离75℃、90% HAc/H2O的水溶液,最优化条件下制备的ZSM-5分子筛膜表现出优良的渗透汽化性能,渗透通量和分离因子分别为0.98kg/(m2·h)和890。此外,本研究所采用制备耐酸性ZSM-5分子筛膜的方法表现出良好的重现性,重复制备的12根ZSM-5分子筛膜在75℃下分离90% HAc/H2O的水溶液时,平均通量和分离系数分别为(0.85±0.15)kg/(m2·h)和650±290。再者,ZSM-5分子筛膜在45~75℃的温度范围内分离50%-95% HAc/H2O水溶液时都表现出优良的渗透汽化性能。(化工进展,2016年第9期)

 

基于云监测平台的实时数据监测

针对传统实时数据监测方式的不足,提出一种基于云监测平台远程处理实时数据的新型监测方法。将数据实时传送至Storm数据处理平台,采用实时数据跟踪算法来确保数据的完整性。在数据库中采用发布/订阅的数据存储方案,将My SQL和Redis数据库相结合,实现了数据的快速存取。最后,依据客户端的Highcharts图形可视化技术让用户通过终端浏览器进行实时监测,获取各种结果。实验表明:该方法比传统监测方法的时间消耗低,实时性明显较强。(化工自动化及仪表,2016年第9期)

 

银纳米相吸收增强型钙钛矿太阳电池薄膜的制备及性能研究

分别将银纳米相溶胶(银纳米颗粒、Ag@SiO2核壳结构、银纳米线)掺入氧化铝异丙醇溶液中制成具有蜂窝结构的介孔层材料, 然后在介孔层表面制备CH3NH3PbI3钙钛矿吸收层,得到Al2O3/CH3NH3PbI3复合薄膜, 并对复合膜的微观结构、光吸收特性及太阳电池器件性能进行了测试和分析。研究表明, Al2O3/CH3NH3PbI3复合膜与CH3NH3PbI3在可见光区域吸收光谱基本相同, 含量极少的Al2O33对CH3NH3PbI3吸光性能影响较小。而掺入银纳米相可明显改善CH3NH3PbI3钙钛矿薄膜的吸收性能。当银纳米颗粒、Ag@SiO2核壳结构和银纳米线相对浓度比分别为0.15、0.3及0.15时, CH3NH3PbI3吸光性能分别达到最佳; 银纳米相浓度继续增大时, 薄膜的光吸收性能逐渐减弱。此外, 掺入Ag@SiO2核壳结构可使钙钛矿薄膜太阳电池光电转换效率由6.28%增大到7.09%, 而银纳米颗粒和银纳米线由于会增大太阳电池内部载流子传输路径, 提高电子空穴对复合效率, 最终反而降低了太阳电池短路电流密度和光电转换效率。(无机材料学报,2016年第9期)

 

固体酸法合成1,6-己二醇二丙烯酸酯的工艺研究

文章研究开展了固体酸催化剂对1,6-己二醇二丙烯酸酯的合成工艺过程研究,在1,6-己二醇二丙烯酸酯的合成工艺研究中,以自制的XDP催化剂和SO2-4/Ti O2/γ-Al2O3复配型剂型为催化剂,以1,6-己二醇的转化率为评价指标,利用单因素实验,对1,6-己二醇转化率和1,6-己二醇二丙烯酸酯选择性进行分析。利用Box-Behnken响应面法对1,6-己二醇的转化率进行优化,得出最佳的合成工艺条件:酸醇摩尔比3.6∶1,催化剂加入量12.4%,反应时间4.7 h,反应温度133.2℃,在此条件下进行5次平行实验,得到1,6-己二醇转化率为97.8%。(化学工程,2016年第8期)

 

内循环流化床吸附-膜分离工艺的饮水除氟特性

将内循环吸附与膜分离技术联合,开发一种新型饮水除氟工艺。为明确工艺特性,以模拟高氟水为实验原水,采用连续流小试装置,通过单因素实验和响应面法分析了HRT、吸附剂投加量2个重要参数对工艺除氟效能的影响规律。结果表明,HRT与活性Al2O3投加量对工艺的除氟效能均存在显著影响,在一定条件下存在最优值。响应面分析结果表明,最佳条件为:HRT=3.2 h,活性Al2O3投加量为5 g·L-1。该条件下,出水氟浓度最低可降至0.2 mg·L-1,在瞬时出水氟浓度与累积出水平均氟浓度超标前,单位活性Al2O3的处理水量分别为1.15 t·kg-1和1.36 t·kg-1;工艺运行过程中,TMP处于较低水平且增加缓慢,表明膜污染程度较小;基于吸附原理与物料平衡原理建立了工艺连续流动态数学模型,模拟得出的出水氟浓度动态变化曲线与实测结果较为一致。(环境工程学报,2016年第9期)

 

 

 

论文题录:

三联吡啶衍生物Hg2+探针的合成、离子识别及量化计算(精细化工,2016年第9期)

还原敏感胱氨酸二甲酯交联PMAA纳米水凝胶的制备(精细化工,2016年第9期)

聚酰胺-胺型树枝状水性聚氨酯的合成与表征(精细化工,2016年第9期)

2-溴苯酚合成工艺的优化研究(精细化工,2016年第9期)

反相乳液聚合法制备HACC及其絮凝性能研究(精细化工,2016年第9期)

甲醛在有无苯作用下对细胞因子M-CSF、G-CSF和EPO转录的影响(化学与生物工程,2016年第8期)

基于显微操作的高效细胞电融合芯片的设计(化学与生物工程,2016年第8期)

气液交叉流系统除尘效率分析及其数值模拟(化工学报,2016年第9期)

甲醇氧化制甲醛铁钼催化剂表面结构与活性(化工学报,2016年第9期)

不同粒径Pd/Al2O3催化乙炔加氢反应微观动力学分析(化工学报,2016年第9期)

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综述:

亲和仿生层析及在抗体纯化中的应用

(国家自然科学基金项目)

引言

所谓亲和仿生层析就是模拟亲和层析的分离原理,即基于抗原-抗体、酶-物或激素-受体间的高度特异性相互作用来进行层析分离,并对配基进行特别设计的一种新型的生物分离技术,可用于生物活性物质尤其是蛋白的分离纯化。与亲和层析类似,亲和仿生层析是利用目标蛋白与仿生配基间特异且可逆性结合的特性,从复杂的生物样品中分离目标蛋白,具有选择性强、纯化效率高等特点。亲和层析介质一般以固定化生物来源的蛋白基团作为功能配基,亲和力和特异性较强,是生物分离中效率和选择性最高的分离方法。然而生物亲和配基通常成本高、不稳定、洗脱条件苛刻等,这些缺点一定程度上限制了亲和层析的应用。因此,寻求一类与生物亲和配基具有相似活性、通过人工合成的小分子化合物,并取而代之,已成为克服生物亲和配基缺憾的重要途径。亲和仿生层析就由此而产生。

亲和仿生层析研究的初期阶段主要是利用常见的基团特异性化合物作为仿生配基,其中最具代表性的是金属螯合类、活性染料类,这些配基结构较为简单,研究者对配基的选择和利用仅建立在一般的经验之上,并未有针对性地进行筛选和设计,因此得到有价值的配基并不多,对目标蛋白的选择性也不如生物亲和配基。直到20 世纪80 年代中后期,随着组合化学和高通量筛选技术的发展,亲和仿生配基的研究进入了快速发展的阶段。研究者们开始针对目标蛋白进行理性设计,采用不同的方式建立仿生配基库,通过高通量筛选得到热点配基,再利用这些热点配基制备亲和仿生介质,通过目的明确的层析实验,最终筛选得到适用于目标蛋白的亲和仿生配基。蛋白晶体解析技术的快速发展和计算机分子模拟技术的不断进步,也为设计新型的亲和仿生配基提供了强有力的技术支撑。通过分子模拟对蛋白结构和潜在的配基结合位点进行分析,采用分子对接和分子动力学模拟等手段设计和筛选出潜在的配基,可以对实验研究进行合理指导,有效降低实验筛选的盲目性,节省研发时间和成本。

抗体是一类重要的生物技术药物,具有特异性高、靶向性强和毒副作用小等优点,应用前景广阔。目前蛋白A 亲和层析是抗体分离的平台技术,特异性高,但由于采用蛋白类的生物亲和配基,存在介质成本高、洗脱条件苛刻、配基易脱落等问题,因此寻求经济高效的抗体分离新方法具有重要的意义。研究者发现,通过对配基进行理性的设计和筛选,基于小分子化合物的亲和仿生层析在保证高亲和力的同时,可以很好地弥补蛋白A 蛋白配基的不足,应用于抗体分离纯化中,可以得到很好的效果。本文将根据近年来国内外亲和仿生配基的研究进展,着重介绍亲和仿生配基的设计、筛选以及在抗体纯化中的应用。

 

1  亲和仿生配基

生物体内存在一些大分子具有与某些分子产生特异性结合的能力,例如抗原-抗体、酶-底物、激素-受体等。亲和层析正是利用这种特异性结合的能力即亲和性,从复杂的生物样品中纯化目标分子,优缺点都非常明显,专一性强、分离效率高是主要的优点,但由于一般以固定化生物来源的蛋白基团作为功能配基,成本高、不稳定、洗脱条件苛刻。亲和仿生层析就是要在保持亲和层析优点的基础上,改善其缺点。主要特点在于利用一些与目标分子具有一定特异性和亲和力的小分子功能基团作为配基,模拟生物亲和作用,以达到纯化目标分子的目的。亲和仿生层析的作用模式与亲和层析类似,可以分为上样、亲和吸附、洗脱和再生几个过程,但条件控制尤其是洗脱条件相对简单。以抗体的分离为例,理想情况下,亲和仿生配基只能够特异性识别目标抗体,而对其他组分的非特异性吸附很小,因此经过一次层析分离即可从复杂料液中获得高纯度的抗体产品。

亲和仿生层析的关键在于合适的配基,理想的亲和仿生配基应该具备以下几个特点:配基能够与目标蛋白可逆结合,具有足够的亲和力和选择性;配基易于获得,并易于固定化于层析基质成为亲和仿生层析介质;配基对层析操作条件具有足够的生物和化学稳定性,不易被降解,也不易脱落而造成产品的污染;配基与目标蛋白的结合常数不能太高以保证目标蛋白和配基能够在相对温和的条件下解离。以上这些特点仅是对亲和仿生配基的一般性要求,而实际应用过程中由于目标蛋白的种类繁多,立体结构和理化性质不尽相同,因此针对某种特定的目标蛋白,必须开发相适应的仿生配基。

根据仿生配基的组成,目前主要有化学合成配基和短肽仿生配基两种。

1.1 化学合成仿生配基

通过化学方法合成亲和仿生配基,要求分子量相对较小,与目标蛋白具有一定的亲和性,并能够以共价键的方式偶联到基质上。目前适用于蛋白层析分离的化学合成配基并不多,主要分为两类:基于三嗪结构的配基,多组分反应合

成的配基。

三嗪类仿生配基可以通过三氯代三嗪与3 种不同的化学取代基的反应获得,这种取代反应受到温度的调控。其中3 种取代基可以直接从基本胺类物质中选择,也可以通过分子模拟做初步筛选。通常在低温下将三氯代三嗪偶联到氨基活化的层析基质上,保留两个取代位点;进一步与具有目标蛋白具有亲和性的另外两个取代基进行反应,见图1。

 

 

 

三嗪类化合物的合成路径需要多步,反应温度在0~90℃变化,苛刻的反应条件限制了配基合成过程的放大。Ugi 等提出了四组分合成反应的概念,通过一步化学合成法就可以得到仿生配基。四组分包括乙醛(作为活化基质的一部分)、羧基化合物、伯胺以及异腈结构,如图2 所示。配基以乙醛功能化的基质为中心,羧基化合物、伯胺和异腈结构则具有多样性,针对特定目标蛋白可以筛选特异性的取代基,从而实现亲和结合。

 

 

 

与传统反应相比,多组分反应具有一些突出的优点。首先,多种组分共同参与反应,每种组分的结构变化将形成配基结构的多样性;其次,快速的化学取代过程可以在相对较短的时间内提高仿生配基的设计空间;最后,多组分反应通过“一步法”完成,可以有效节省时间和试剂用量,简化中间产物的分离操作,可以考察多种化合物,也给过程放大带来便利。

1.2 短肽仿生配基

短肽化合物以氨基酸作为原料,通过设计、筛选和优化可以保证与目标蛋白的亲和性,又具有一定稳定性和很好的生物相容性,非常适合作为仿生配基应用于高附加值生物活性物质的分离纯化。以短肽化合物作为新型的亲和仿生配基,可以突破一些传统配基的局限性,成为近年来的研究热点。

1986 年,Geysen 等指出:含关键氨基酸残基的短肽可以模拟蛋白上的决定簇;多数情况下,短肽与目标蛋白结合的相互作用力主要由关键残基的非共价作用提供,这两个观点奠定了短肽配基的理论基础。短肽配基通常由8~10 个氨基酸残基组成,一方面可以避免分子内部折叠,降低短肽合成的难度;另一方面即使配基从固定相上脱落渗入产品中,也不会引起免疫中毒反应,且很容易从最终产品中除去。此外短肽配基与蛋白的作用条件温和,有利于洗脱条件的控制,避免目标蛋白的变性;具有与生物亲和配基类似的亲和力,同时构象和理化性质则更为稳定,能够耐受层析分离中较强的再生条件。

短肽固相合成技术的建立和短肽合成方法的成熟极大地提高了人工合成多肽的效率,推动了组合肽库和短肽仿生配基筛选的发展。图3 是组合肽库的构建方法,短肽合成的循环次数是由构成短肽的氨基酸数量所决定,肽库中的短肽配基数目取决于短肽的长度以及所用氨基酸的数目。若以天然氨基酸作为原料,构建的组合肽库中短肽配基数目可达百万,若引入非天然氨基酸,则短肽配基库又会得到进一步的扩大,从而显著增加了配基筛选的难度。因此,最好的方法就是在构建组合肽库时,对氨基酸的种类有所选择,实现仿生配基的理性设计,限制待筛选配基库的大小。

 

 

图3 组合肽库构建方法示意图

 

2  仿生配基的理性设计

无论是化学合成配基还是短肽配基,构成配基的功能基团或者氨基酸残基的种类都很多,理论上可能出现上亿种组合,随机选择的效率很低,因而采用理性设计方法,构建一个合理的配基库是十分必要的。基于蛋白结构解析技术的快速发展,研究者可以获得高精度的蛋白空间结构信息,为计算机辅助配基设计提供了基础。计算机分子模拟技术也在不断进步,可以从蛋白的高级结构入手,研究蛋白和配基之间的相互作用,为设计新型的仿生亲和配基提供了有效的技术支持。通过分子模拟对蛋白结构和潜在的配基结合位点进行分析,采用分子对接和分子动力学模拟等手段优化配基结构,可以有效降低实验的盲目性,节省实验成本,提高研发效率。计算机辅助配基设计,一般可以从两个方面入手:一是分析已有天然配基和目标蛋白的结合模式,以天然配基活性位点的关键残基作为模板进行理性设计;二是针对目标蛋白表面潜在的活性部位,设计与其结构互补的化合物作为仿生配基。

2.1 模拟天然配基结构的理性设计

蛋白的生物学功能依赖于其与其他分子的相互识别和相互作用,从而形成具有特殊功能的复合物。因此,可以通过分析蛋白和天然配基间的结合模式,确定天然配基的关键残基,并以此作为模板设计仿生亲和配基。

Lowe 教授课题组借助计算机分离模拟开发了基于三嗪结构和Ugi 反应的仿生亲和配基,用于纯化IgG。模拟蛋白A 的关键残基Phe132-Tyr133,将三嗪取代基确定为苯丙氨酸和酪氨酸,得到仿生配基ligand22/8,用于单克隆抗体和Fc 融合蛋白的分离纯化,取得蛋白A 亲和层析相媲美的纯化效果。模拟蛋白L,以苯甲酰胺和丁酸作为取代基,得到仿生配基ligand8/7,用于纯化抗体以及Fab和scFV 片段。Platis 等也采用类似的方法,模拟包膜蛋白gp41 的关键残基,设计并合成了仿生配基4E10lig,用于从转基因烟草中分离HIV 单克隆抗体4E10。Maltezos 等设计并合成了三嗪类仿生配基4ABS-trz-4ABS,一步层析从转基因玉米中分离单抗2G12。Qian 等以蛋白G 与IgG 的Fc 片段特异性结合的热点残基Asn35 和Trp43 作为模板,设计并合成了以对氨基苯甲酰胺和乙酸作为功能化取代基的亲和仿生配基A2C11l1,该配基与Fc 片段的结合模式与蛋白G 基本吻合,可以作为纯化抗体的有效手段。Khoury 等则模拟蛋白G 与IgG 的Fab片段结合的热点残基,通过理性设计合成了以氨基苯甲酰胺和羟苯基乙酸作为取代基的亲和仿生配基A2C7l1,计算机模拟结果显示该配基能够与Fab 分子的CH1 结构域结合,进一步通过电离质谱以及核磁共振得到验证。Khoury 等通过模拟促红细胞生成素受体(EPOR)的关键残基Phe93、His114 和Glu117,设计得到以组氨酸和琥珀酸作为取代基的仿生配基A9C10I8,一步层析从细胞培养液中分离得到高纯度的重组红细胞生成素。

对于多肽仿生配基,同样可以采用天然配基作为模板进行理性设计,进一步利用分子模拟研究蛋白与配基间的相互作用,优化配基结构和空间分布,得到性能更加优良的多肽配基。Salvalaglio 等利用分子动力学模拟详细考察了蛋白A 片段B 与IgG的Fc 片段复合物的作用机制,为蛋白A 仿生配基的理性设计提供指导。结果表明,蛋白A 和IgG 之间主要是通过静电相互作用和范德华相互作用结合;蛋白A 上的Gln129、Phe132 和Lys154 是关键氨基酸残基,对结合起主导作用,同时Tyr133、Leu136、Glu143 和Gln151 对结合的贡献也比较大。Huang 等考察了蛋白A 与IgG 的结合模式,发现疏水作用占据主导地位,进一步分析表明,蛋白A的关键残基为Phe132、Tyr133、His137、Glu143、Arg146 和Lys154,而IgG 的关键残基为Ile253、His310、Gln311、Asp315、Lys317、Glu430 和Asn434。基于上述结果,Zhao 等考虑到6 个热点残基的空间分布,通过理性设计构建了一个包含2173 个短肽的仿生配基库;利用分子对接筛选得到15 个待选配基;通过分子动力学模拟分析15 个配基与IgG 的作用机制,并将亲和性最高的配基FYWHCLDE 成功应用于IgG 纯化分离。Tong 等采用分子动力学模拟方法,考察了7 种结合在抗体保守区域的天然配基与Fc 片段的相互作用,发现疏水相互作用是主要驱动力,分析发现天然配基的热点残基均包括色氨酸或酪氨酸,提出了两种不同的结合模式,以及仿生配基选择和空间分布的建议。基于色氨酸结合模式,Tong 等设计了色氨酸-氨基苯并咪唑的杂合配基W-ABI,并制备亲和仿生层析介质,对抗体具有高度亲和性,且在温和的条件下可实现有效洗脱,取得理想的收率和纯度。另外,Wang 等结合分子对接和分子动力学模拟,研究了新型短肽配基 DAAG 与抗体Fc 片段之间的相互作用机制,指出 DAAG 配基以类似三脚架的结合方式作用于Fc 片段保守结合区域附近,其中静电相互作用与范德华相互作用贡献相当,提出了短肽配基设计时应考虑含疏水芳香环的氨基酸和带正电的精氨酸。

通过模拟天然配基结构来理性设计亲和仿生配基,也存在一定的局限性。分析原因,其一在于蛋白与天然配基的晶体结构有限,且在很多情况下,与目标蛋白存在特异性结合的天然配基未被发现,或是蛋白-配基复合物结构未被解析。其二在于仿生配基的设计往往只考虑模仿天然配基的热点残基,忽视了配基与蛋白之间的空间匹配性,在一定程度上可能造成仿生配基与天然配基的作用位点不一致。

2.2 基于目标蛋白结构的理性设计

在无法得到蛋白-天然配基复合物结构的情况下,可以直接从目标蛋白的高级结构出发,分析潜在的结合位点,设计出与目标蛋白活性位点或暴露于蛋白表面的氨基酸残基互补的亲和配基。

Sproule 等通过同源建模的方法构建出重组人胰岛素前体(MI13)的三维结构,以其表面的疏水特征区域作为目标结合位点,设计仿生亲和配基,构建了含66 个基于三嗪结构的配基库,从中筛选得到与MI13 具有较强亲和力的配基ligand2/2,取代基为两个氨基萘醇,成功实现酿酒酵母细胞发酵液中纯化MI13。Baumann 等以猪胰腺á淀粉酶(PPA)的催化活性位点作为靶点,通过理性设计构建了一个含53 个潜在配基的仿生配基库,利用分子对接和实验相结合进行筛选, 得到了配基G5-A33;进一步偶联于琼脂糖凝胶制备仿生介质,发现可以通过PPA 抑制剂实现PPA 的洗脱,证实了该配基确实结合于PPA的活性中心。Carredano 等以人IgG κ-Fab 片段的CH1 和CL 间的保守口袋区域作为靶点,设计并计算机虚拟筛选得到249 个待选配基,进一步结合饱和转移差谱NMR(STD-NMR)和表面等离子体共振(SPR)手段进行二次筛选,最后得到了3 个高特异性的仿生亲和配基。Liu 等以组织型纤溶酶原激活物t-PA 的表面口袋结构作为靶点,理性设计并通过分子对接筛选得到了一种四肽仿生配基QDES,通过分子模拟证明了配基通过静电相互作用以及氢键与t-PA 相结合,偶联配基制备仿生介质,可以从猪心提取液中纯化t-PA。

基于目标蛋白结构的理性设计方法高度依赖于对目标蛋白结构的认知,根据目标蛋白的结构参数,设计出有利于与目标蛋白作用的仿生配基,并通过实验验证和后续结构优化以提高性能。当无法得到目标蛋白的晶体结构时,则可通过同源建模方法构建蛋白结构,也已应用于配基的理性设计。

 

3  仿生配基的筛选技术

不管是基于天然配基还是目标蛋白结构的理性设计,都可以得到相对适合目标蛋白的潜在配基,构建一个合理的配基库,大大降低仿生配基库的容量大小。为了得到更为合适的仿生配基应用于实际分离,还必须对潜在配基进行进一步的筛选。配基设计和筛选过程,既要关注配基与目标蛋白的特异性结合,同时还要兼顾蛋白与配基的解离条件,避免蛋白活性发生变化。目前比较成熟的筛选方法有组合化学法、噬菌体展示法以及计算机辅助法。

3.1 组合化学技术

组合化学是一种化学合成策略和筛选方法,最大的优势在于能够在短时间内合成大量的化合物,构建组合库,从而实现具有某种物理、化学性质或生物活性的化合物的快速筛选。组合化学技术在新材料、药物、催化剂等领域有着广泛的应用,也可作为筛选化学合成和短肽仿生配基的有利工具之一。

利用组合化学高通量筛选仿生层析介质如图4所示,一般包括以下步骤:(1)构建组合化学库,选择合适的小分子化合物或氨基酸作为配基偶联到固定相上;(2)初步筛选,目标蛋白用荧光染料或生物素标记,利用目标蛋白和备选化合物之间亲和性的差别进行筛选,与目标蛋白结合较好的化合物可作为阳性配基;(3)鉴定化合物序列,利用HPLC/MS、MALDI-TOF-MS 等方法对阳性配基进行解析和鉴定;(4)配基合成、偶联和评估,利用固相法合成仿生配基,偶联到合适的层析基质上,考察目标蛋白的吸附和分离性能;(5)应用验证,仿生介质应用于实际分离体系,验证分离效果。

 

 

 

由于化学合成配基和短肽配基的构成单元有所差别,组合化学库的筛选策略也有所差异。对于化学合成仿生配基,一般采用离散实验法。将偶联待筛选配基的固相分散在96 孔板中,在不同液相条件下与目标蛋白样品进行平行的吸附实验,挑选出高效结合目标蛋白的配基进行后续测序分析。Saraswat 等详细描述了96 孔板平行实验法从组合化学库中筛选特异性结合人血清白蛋白HSA 的配基过程。Teng 等利用组合化学对含88 个与IgG结合的候选配基库进行筛选,得到了仿生配基ligand 22/8,可以将IgG 从人血浆中高效分离出来。Roque 等 通过理性设计和组合化学相结合,获得蛋白L 的仿生配基ligand8/7,可以从hIgG 的木瓜蛋白酶水解液中分离Fab 片段。Haigh 等研究多组分Ugi 反应合成仿生配基时,也是采用组合化学法对取代基进行筛选。

短肽配基库的高通量筛选不仅可以采用离散实验法,也可以用“分割和重组”法。具体步骤如下:首先将偶联待筛选配基的固定相与目标蛋白在特定的缓冲液体系中进行吸附反应;然后将固定相与能够和目标蛋白发生免疫反应的标记抗体反应,进行免疫染色;依据免疫染色结果筛选出固定相,并将目标蛋白和标记抗体洗脱;最后进行配基测序分析。该方法虽然快速有效,但可能会出现一些假阳性结果,后续进行了一些改良,如采用酶或荧光物质标记的目标蛋白与固定相发生反应、采用两种颜色的标记物进行标记或采用正交染色法,可以显著减少假阳性结果的产生。Kaufman 等以人血纤维蛋白原为目标蛋白,采用免疫染色技术从短肽库中筛选获得亲和仿生配基FLLVPL。Gurgel等利用组合化学筛选α-乳白蛋白的六肽仿生配基WHWRKR。Yang 等 针对IgG 的Fc 片段构建了一个N 端开始依次为组氨酸-芳香族氨基酸-碱性氨基酸的六肽库,利用组合化学进行三轮筛选,得到了特异性结合Fc 片段的六肽配基HWRGWV,具有广谱的抗体识别能力,可以应用于乳清、脱脂牛奶和牛初乳中纯化IgG 以及细胞培养液中纯化IgG 和IgA。

组合化学法应用于配基高通量筛选的优势在于:固相合成时,液相反应物过量可以促使反应完成,操作简单,终产物收率高。但也存在一定的局限性,如反应的溶剂受到限制,化学合成过程的条件优化较为复杂,且必须通过构建大库容、高质量的随机组合库来实现其多样性,在实际工作中往往比较费时费力。

3.2  噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种利用生物技术手段快速构建随机多肽库的方法。基本原理是将一段编码多肽的随机基因片段插入噬菌体基因,并与噬菌体外壳蛋白进行融合表达,利用噬菌体能够大量复制的特点,从而快速得到外壳含不同多肽的噬菌体展示库。一般可以通过降解DNA 链或直接将某个基因的全部序列随机插入,从而得到一个噬菌体展示多肽库。

插入基因所表达的多肽一般呈线性展示在噬菌体的表面,然后可以利用目标蛋白对噬菌体展示库进行筛选。目标蛋白选择性地与外源肽结合,分离出含目标多肽的噬菌体,经过3~5 轮的“吸附-洗脱-扩增”筛选,可以使含有高亲和力多肽的噬菌体高度富集,最后合成该目标多肽,考察蛋白吸附性能。利用噬菌体展示技术进行肽库筛选的优势在于筛选容量大,且利用噬菌体快速增殖的特性可实现目标多肽的快速富集。Cwirla 等利用噬菌体展示技术,构建了一个可结合抗体和其他受体的多肽库,成千上万的六肽表达在噬菌体表面,筛选出高效结合单克隆抗体3-E7 的多肽。经过三轮筛选,得到了51 个多肽配基,化学合成其中6 种,测得单抗3-E7 的结合常数在0.35-8.3 μmol·L-1 之间。Huang 等针对人血浆中糖蛋白vWF,利用噬菌体展示技术筛选得到了特异性结合的多肽配基RVRSFY,发现仿生介质与vWF 之间通过静电和疏水相互作用结合。Gaskin 等基于丝状噬菌体M13构建了一个七肽配基库,筛选出脂肪酶的亲和配基,通过ELISA 法确定亲和性最好的配基,偶联到琼脂糖凝胶制备仿生介质,但纯化效果并不十分理想,表明七肽与脂肪酶之间的亲和力不仅与多肽序列有关,也可能与噬菌体的外壳蛋白相关。Ehrlich 等以人源抗Tac 单克隆抗体(HAT)作为目标蛋白,利用噬菌体展示技术筛选与其保守区域具有亲和性的多肽配基,构建了七肽库和十二肽库,进行四轮高通量筛选,并根据蛋白A 同源性的高低程度进行排序,得到了5 种多肽配基,发现EPIHRSTLTALL短肽仿生介质效果最好。

噬菌体展示技术可以作为多肽库的高通量筛选手段,不过也存在着一些缺点 。例如,宿主细胞对于多肽具有一定的选择性,一些亲和性好的多肽可能由于对宿主生长不利或者具有毒性而被排除;筛选的多肽在游离状态时对目标蛋白的生物活性下降或消失;筛选多肽难以偶联到基质等。

3.3  计算机辅助筛选技术

针对目标蛋白,无论是组合化学还是噬菌体展示,都是基于实验的高通量筛选手段,工作量巨大。一些学者探讨借助计算机辅助手段进行虚拟筛选,具有不消耗实验耗材、节省人力和时间成本等优势。近年来,计算机性能不断提高,分子模拟技术飞速发展,研究者可以从原子尺度来研究分子间相互作用模式,探讨结合过程中作用力和结构的变化,从而为仿生配基的筛选提供了新的途径。目前常用的方法包括分子对接和分子动力学模拟。

分子对接基于分子间的空间匹配和能量匹配,预测两个或多个分子间的识别过程,广泛应用于研究小分子与大分子间相互作用、生物大分子识别和药物设计等领域。根据配体-受体的简化程度和方式,可以分为刚性对接、半柔性对接和柔性对接3种,其中半柔性对接兼顾了计算量和预测能力,应用较为广泛。常用分子对接软件包括DOCK、Autodock、LUDI、GOLD、FlexX、LigandFit、Glide和ICM-Dock 等。分子动力学模拟以牛顿经典力学为基础,通过数值求解的方式来描述体系的运动方式,模拟体系随时间的动态演化过程,在生物大分子结构和功能研究领域得到广泛应用。根据分子力场的简化程度,可以分为全原子力场、联合原子力场以及粗粒化力场3 种,主要有AMBER、CHARMM、GROMACS、GROMOS 和MARTINI等力场。分子动力学模拟可以计算蛋白与配基之间的相互作用能,从而评价二者间是否存在特异性结合。由于蛋白分子量较大,分子动力学模拟的计算量大,耗时长,通常需要与一些高通量的筛选方法(如分子对接等)结合使用,利用分子对接进行初筛,然后采用分子动力学模拟开展精确验证。

对于化学合成的仿生配基来说,潜在的功能取代基的数目巨大,采用计算机辅助手段对取代基进行筛选,可以大大减少工作量。Li 等研究了蛋白A 和IgG 的Fc 片段间的特异性识别位点,设计了一系列三嗪类仿生配基,利用分子对接进行筛选,得到了一个能够与蛋白A 竞争的仿生配基ApA,与IgG 的结合常数为105-106 L·mol-1。Feng 等利用分子对接,从200 个类似于蛋白A 活性位点结构的化合物库中筛选出了一个仿生配基N-cbz-L-Tyr , 与IgG 的结合常数为4.91×106  L·mol-1。Qian 等利用多组分Ugi 反应合成蛋白G 仿生配基时,基于蛋白G 和鼠源IgG1 的Fab 片段结合区域的X 射线晶体结构,理性设计一些潜在的功能取代基,将配基与Fab 片段进行分子对接,筛选得到了A2C7l1 仿生配基,可以从哺乳动物或者酵母细胞培养液中纯化得到IgG 和Fab 片段。

计算机辅助技术也被应用于短肽仿生配基的筛选。Liu 等使用柔性对接,对理性设计的多肽配基库进行筛选,建立了一个可以评价多肽配基与目标蛋白之间亲和力的打分函数,由分子对接计算Dscore 值直接用于评价亲和力。基于α-淀粉酶,筛选得到六肽配基FHENWS, 表观结合常数为2.5×105 L·mol-1,偶联FHENWS 六肽配基制备仿生介质,实现从谷草芽孢杆菌粗发酵液中分离α-淀粉酶。Liu 等利用分子对接和分子动力学模拟相结合的手段,筛选得到了针对组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的短肽配基。首先构建了一个含14 个四肽的短肽配基库,在目标蛋白的待定结合口袋进行分子对接,评价配基与目标蛋白的亲和性,筛选得到了高亲和性的四肽配基QDES,进一步利用分子动力学模拟验证QDES-t-PA 复合物的结合稳定性。偶联QDES 配基于琼脂糖凝胶,通过一步层析从猪心提取液中分离得到纯度较高的t-PA。Aghaee 等也利用分子对接和分子动力学模拟相结合,筛选得到人血清白蛋白的短肽配基。基于HSA 的待定结合口袋建立一个短肽配基库,采用分子对接进行筛选,计算二肽与HSA 之间的亲和力,筛选得到二肽配基Trp-Trp , 在尾部添加空间臂Lys[CO(CH2)5NH],进一步进行分子对接,并对配基-蛋白复合物进行分子动力学模拟,结果表明配基与蛋白可以实现紧密结合。

 

4  亲和仿生层析在抗体分离纯化中的应用

抗体是一类重要的生物技术药物,亲和仿生层析作为一种新型的生物分离技术,因其价格相对低廉、结构稳定、特异性较高、纯化过程更易于控制等优点,在抗体纯化中表现出良好的应用前景。针对特定抗体,可以通过计算机辅助技术和实验研究相结合的方法,得到高度亲和与特异性的仿生亲和配基。

4.1 化学合成配基

4.1.1 三嗪类仿生配基   三嗪类化合物作为重要的化学合成仿生配基,已成功用于抗体的分离纯化,表1(略)列举了近年来用于抗体分离的三嗪类仿生配基。剑桥大学Lowe 教授课题组在该方面做了大量工作,通过分子模拟等手段大大缩小了相关胺类物质的筛选范围。Li 等以蛋白A 作为模板,设计了基于三嗪类的仿生配基。通过分析蛋白A 与IgG-Fc 片段复合物的晶体结构,确定二者间的特异性识别位点,用计算机辅助分子模拟手段设计了一系列仿生配基。其中以关键残基Phe132-Tyr133二肽作为模板设计仿生配基Ligand 22/8,将其偶联到琼脂糖基质上用于分离血浆中的抗体,吸附容量可达到50 mg·g-1 以上,抗体收率大于60%,纯度大于92%,且该介质可以在1 mol·L-1 NaOH 中保存7 d。基于该配基的商业化介质MabSorbent A1P,已应用于单克隆抗体和Fc 融合蛋白的分离纯化,可以达到蛋白A 亲和层析的效果。另一种衍生的商业化仿生介质MabSorbent A2P,以p-氨基苯酚/o-氨基苯酚双取代三嗪作为功能化配基,也可以达到很好的抗体分离效果。

Roque 等以蛋白L 作为模板,利用理性设计和组合化学的方法设计了仿生配基Ligand 8/7,用于纯化抗体以及Fab 和scFV 片段,可以从hIgG 的木瓜蛋白酶降解液中分离Fab 片段,纯度达97%。Platis 等和Maltezos 等则分别针对抗HIV 的单克隆抗体4E10 和2G12,设计并合成了三嗪类仿生配基4E10lig 和4ABS-trz-4ABS,采用一步层析从转基因烟草和转基因玉米中分离单抗。

Telma 等利用一种更为绿色简单的方法合成了仿生配基TPN-BM,解决了Ligand22/8 配基的溶解限制。以醚键替换了传统三嗪仿生配基中取代基与三嗪核心结构间的氨基结构,配基合成反应温度控制在0℃,催化剂也更为绿色安全。将配基偶联到壳聚糖整体柱上,吸附容量高达160 mg·g-1,从哺乳动物细胞培养液中捕获单抗,收率达85%,纯度高达98%。

4.1.2 多组分反应合成的配基  Lowe 教授课题组开发了多个Ugi 反应合成的仿生配基,应用于抗体的分离纯化,配基结构如表2 所示。Haigh等针对抗体构建了一个由多个伯胺、羧酸和异腈组成的化合物库,结合计算机辅助手段和层析过程筛选,采用Ugi 反应合成了一种蛋白L 的仿生配基A3C1I1,偶联于琼脂糖凝胶制备仿生亲和介质,发现配基可以特异性地与IgG 的Fab 片段结合,而不与Fc 片段发生作用,Fab 片段的静态吸附容量约16.6 mg·g-1,亲和常数为2.6×10-6 mol·L-1。Qian等通过Ugi 反应合成了一种仿生配基A2C11I1,模拟蛋白G 的Asn35 和Trp43,与来源于人、牛、羊、鼠、猪、兔血清的IgG、鸡血清IgY 以及重组骆驼Fc 结构域均有较好的亲和性。Khoury 等也采用Ugi 反应合成了蛋白G 的仿生配基A2C7I1,分子模拟分析表明配基与IgG 的Fab 片段的结合位点在CH1 区域,偶联A2C7I1 配基制备仿生介质,从哺乳动物细胞培养液中纯化IgG 和Fab 片段,收率达99%,纯度93%。

 

 

 

4.2  短肽仿生配基

近年来应用于抗体分离纯化的短肽仿生配基如表3 所示,主要包括多聚肽、线性肽以及环肽配基。

4.2.1 多聚肽配基  Fassina 等通过筛选多聚肽库,得到可以特异性识别IgG 的Fc 片段的多聚肽,命名为TG19318。合成过程可以在溶液或固相中进行,产率高而成本较低,该配基与IgG 的亲和常数接近0.3 μmol·L-1,吸附容量略低于蛋白A 配基,不过可特异性结合的抗体种类更为广泛,可以用于不同动物的血清和哺乳动物细胞培养液中分离IgG,以及卵黄中分离IgY,纯度均在95%以上。Palombo 等将TG19318 配基用于从细胞培养液和血清中分离IgA,腹水中分离IgE,血清、腹水、细胞培养液中分离IgM,均取得了良好的分离效果。Verdoliva 等进一步对配基进行了改造,采用非天然D 型氨基酸取代所有的天然氨基酸,发现D-PAM 功能化的仿生介质可以直接从血清中捕获IgG,收率为60%~90%,纯度90%。与蛋白水解酶接触1 h 后,水解比例小于10%,说明D-PAM 配基既保持了PAM 与抗体结合的特异性,又提高了对蛋白酶的耐受性。

 

 

 

4.2.2 线性肽配基  Carbonell 教授课题组对线性短肽配基进行了深入研究,在介质的吸附性能(静态和动态吸附能力)、不同分离对象(动物血清、细胞培养液、乳清等)、配基-抗体相互作用机理等方面均有报道。Yang 等设计了以组氨酸作为N 端、包含芳香族和带正电氨基酸残基的六肽组合化学库,通过三次筛选得到了能够特异性识别IgG-Fc片段的六肽配基HWRGWV,对Fc 片段的选择性与蛋白A 相仿,从哺乳动物细胞培养液中捕获hIgG,纯度和收率均可达到95%。研究表明,HWRGWV六肽配基与IgG 的结合位点与蛋白A/蛋白G 并不一致,质谱和分子对接分析表明HWRGWV 结合位点在pFc 区域,与CH3 域的Ser383-Asn389 环发生作用。以六肽HWRGWV 作为功能配基,偶联于层析基质制备仿生介质,经基质改造和层析过程优化,实现从CohnⅡ+Ⅲ组分中纯化IgG、IgA 和IgM,乳清、脱脂牛奶和牛初乳中纯化IgG,以及细胞培养液中纯化IgG 和IgA。值得关注的是,Menegatti 等通过介质表面化学改性,避免配基偶联时酯键的形成,制备出耐碱的HWRGWV 六肽仿生介质,经过200 次0.1 mol·L-1 NaOH 再生循环,IgG 收率从91%下降到85%,而纯度保持在95%左右。

Sugita 等通过考察IgG-Fcγ 受体与Fc 片段的相互作用,采用点合成多肽阵列技术合成了两种亲和力较强的八肽配基NKFRKYK 和NARKFYKG,与IgG-Fc 的亲和常数分别为8.9×106 L·mol-1 和6.5×106 L·mol-1,不过从细胞培养液中分离IgG和Fc 片段时,纯度分别仅为83%和68%。

Zhao 等以蛋白A 与IgG-Fc 片段具有特异性结合的6 个热点残基(F132、Y133、H137、E143、R146 和K154)为基础,引入半胱氨酸作为配基偶联残基,并充分考虑热点残基的空间距离等因素,将19 种氨基酸插入到热点残基中,构建了一个多肽库;采用分子对接和分子动力学模拟的方法,筛选出3 种八肽配基FYWHCLDE、FYCHWALE 和FYCHTIDE,均可以有效地将hIgG 从血浆和细胞培养液中分离出来。其中FYWHCLDE 配基的吸附容量最大,分离性能最优。Zhao 等进一步将FYWHCLDE 配基偶联到琼脂糖凝胶上,制备了不同配基密度(10.4-30.1 μmol·ml-1)的八肽仿生介质,考察配基密度对IgG 静态和动态吸附的影响,结果表明随着配基密度的增大,静态吸附容量和动态载量均有明显提高。此外,Zhao 等还将3 种八肽配基两两混合偶联到基质上,制备了3 种双配基亲和体系,发现与单配基体系相比,双配基体系存在协同增强效应,与hIgG 的亲和力更强。

4.2.3 环肽配基  Menegatti 等开发了一种新型的环肽配基cyclo[Link-M-WFRHY-K],能够特异性地结合IgG 的Fc 片段,而不结合Fab 片段,对IgG的吸附容量和解离常数分别为19.7 mg·ml-1 和7.6×10-6 mol·L-1,应用于从CHO 细胞培养液中分离IgG1 和IgG4 时,可在更温和的条件(pH4)下实现洗脱,收率和纯度分别为96%和93%。结果表明,相对于线性肽,环肽配基具有更加合理的空间分布,对抗体具有更强的亲和力和特异性,且对蛋白水解酶的耐受性更好。

综上可见,由于结合组合化学和分子模拟等方法,仿生配基的设计和筛选效率得到了很大的提高,出现了一系列成功应用于抗体分离纯化的仿生配基。然而,值得注意的是仿生配基的合成方法还比较单一,还未能适应抗体结构复杂性的要求,使其整体结构受到了限制,很难像天然生物配基那样实现与抗体在空间结构上的完美匹配,因此选择性低于生物配基。

 

5 总结与展望

亲和仿生层析是一种新型的生物分离技术,可用于生物活性物质的分离纯化,尤其在抗体纯化中表现出良好的前景。亲和仿生配基既具备了小分子配基价格低廉、结构稳定、清洗方便等优点,又显著提高了抗体结合的特异性,分离过程易于控制,显现出良好的应用潜力。

目前应用比较广泛的两种亲和仿生配基是化学合成仿生配基和短肽仿生配基,前者具有合成较为简单、种类多样等优点;后者以氨基酸残基作为原料,生物相容性好,与目标蛋白的亲和性高。无论是化学合成配基还是短肽配基,构成配基的功能基团或者氨基酸残基的种类都很多,随机选择的效率很低,因而采用理性设计方法,构建一个合理的配基库是十分必要的。基于蛋白结构解析的快速发展和计算机分子模拟技术的不断进步,可以利用计算机辅助技术对仿生配基进行理性设计,包括模拟天然配基和基于目标蛋白结构的理性设计。在理性设计的配基库基础上,针对特定分离对象,通过高通量的筛选,最终得到合适的仿生配基。目前比较成熟的筛选方法有组合化学法、噬菌体展示法以及计算机辅助筛选。鉴于仿生配基设计和筛选的复杂性,充分结合计算机辅助技术和实验研究方法,可以提高研发效率,得到高度亲和力和特异性的仿生亲和配基。

针对抗体分离的仿生配基设计和筛选,可以采取如下策略:首先根据抗体结构的特点,分析特征结合部位,利用分子模拟对配基进行理性设计,构建一个仿生配基库,采用高通量方法进行筛选,得到为数不多的潜在配基;合成潜在配基,实验分析配基-抗体相互作用,验证配基与目标蛋白间的亲和性,或者偶联配基制备仿生介质,通过亲和层析进一步筛选,得到特异性结合的仿生亲和配基;对仿生亲和介质的性能(如介质孔径、配基密度、空间臂等)以及层析过程进行优化,应用于实际分离体系。亲和仿生层析已在抗体分离纯化中得到了成功应用,相信随着相关技术的不断进步,越来越多的目标蛋白将可以“定制”仿生配基,实现高效的亲和仿生层析分离。

                                        (化工学报,2016年第9期)

 

联系人: 陈老师

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